Abbiamo visto che la regolazione dell’espressione genica avviene in molti punti. Ci stiamo concentrando sulla regolazione a livello trascrizionale negli eucarioti e in modo particolare sulla regolazione dell’RNA polimerasi II.

(Il prof fa osservare il lucido di un promotore)

Si può osservare nella regione della TATA box la presenza dei fattori di trascrizione generali, che per poter funzionare necessitano di un’altra serie di fattori chiamati fattori di trascrizioni specifici o attivatori. La combinazione dell’azione di questi ultimi consente ai fattori di trascrizione generali di avere accesso al promotore. In ogni cellula e in ogni momento della sua vita, i fattori generali della trascrizione sono sempre espressi e ipoteticamente potrebbero avere accesso a tutti i promotori. Tuttavia i promotori sono da essi raggiunti poiché avvolti e bloccati intorno agli istoni.

Detto ciò capiamo meglio il ruolo dei fattori specifici: consentono l’entrata ai fattori generali nel promotore. Antagonisti dei fattori di trascrizione specifici sono i repressori.

Il fattore specifico consta di tre domini:

Tali fattori funzionano o come omodimeri o come eterodimeri con i fattori specifici (da questo momento per semplicità li chiamiamo attivatori) e con i repressori lavorano altre molecole che cooperano o con i primi o con i secondi e che comprendono i co-attivatori e i co-repressori. Questi ultimi non hanno la capacità di legare il DNA e si legano ad esso solo mediante gli attivatori o i repressori.

Classifichiamo ora i fattori di trascrizione a livello strutturale (è indipendente dal fatto che siano generali o specifici):

• gli HTH (helix-turn-helix = elica-giro-elica): proteine con una regione di 20 amminoacidi a α-elica, una regione a β-elica (il turn), una regione di altri amminoacidi ancora ad α-elica (il secondo helix). Grazie alla struttura α, i fattori di trascrizione prendono contatto con il solco maggiore del DNA.

• gli Zinc-fingers (dita di zinco): sulla superficie della proteina vi sono delle estroflessioni che somigliano a delle dita. L’estroflessione è fatta da una serie di amminoacidi ed è mantenuta da un atomo di zinco (questo ad esempio potrebbe coordinarsi con due cisteine a due istidine). Le estroflessioni possono essere numerose e tramite queste i fattori di trascrizione prendono contatto con il DNA.

• I basic domain (proteine con il dominio basico): hanno una regione a α-elica con amminoacidi di tipo basico che, essendo carichi positivamente, si legano al DNA negativo.

Altri fattori di trascrizione hanno altre strutture:

• · bacterial repressor Arc Mnt

• · TBP

• · cylinder dimer

• · NF-kB

Questi fattori vengono considerati appartenenti alla famiglia degli NF-kB (per primo scoperto) perché hanno una struttura a questi simile.

Altri fattori di trascrizione hanno una struttura simile ad un repressore batterico. Questi usano una struttura β per interagire con il DNA (contrariamente alla gran parte degli altri che interagiscono con il DNA grazie ad una struttura α).

Le proteine che nella struttura sono simili alla TBP (TATA binding protein) appartengono alla famiglia delle TBP.

Vi sono poi i cilindri dimerici : proteine con struttura ad α-elica che formano dei cilindri affiancati.

Altre strutture sono la leucin zipper (serratura di leucina) e la elix-loop-elix (HLH = elica-ansa-elica).

Le proteine con struttura leucin zipper sono sempre dimeriche; hanno una regione che interagisce con il solco maggiore del DNA a una regione idrofobica (o di dimerizzazione) fatta da leucine (le leucine di un monomero interagiscono con quelle dell’altro).

Vediamo ora la classificazione dei co-attivatori e co-repressori, che si possono dividere in due grosse categorie:

• quelli che modificano covalentemente gli istoni (agiscono sui residui amminoacidici degli istoni);

• quelli che modificano la cromatina (la rimodellano con consumo di ATP e non operano modificazioni covalenti).

Il compito di entrambi i tipi è liberare il promotore.

In cosa consiste la modificazione covalente degli istoni?

• le modifiche possono avvenire a carico delle estremità NH ammino terminali degli istoni. Gli istoni maggiormente modificati sono H3 e H4 (entrambi in corrispondenza dell’estremità ammino terminale).

• gli istoni possono essere acetilati in corrispondenza delle lisine e delle arginine. L’acetilazione è operata da enzimi che sono considerati a tutti gli effetti co-attivatori perché fanno staccare gli istoni dal DNA. (NB: gli enzimi che deacetilano HDAC, histon deacitalasi, possono essere considerati invece dei co-repressori).

• gli istoni possono essere fosforilati. La fosforilazione avviene in genere a carico della serina con l’aggiunta di un fosfato.

• gli istoni possono essere metilati. La metilazione avviene a carico della lisina.

• altra modificazione è l’ubiquitinazione

Tutte queste reazioni esistono nelle loro forme complementari: deacetilazione, defosforilazione, demetilazione e deubiquitinazione.

Gli enzimi che acetilano e deacetilano sono facilmente classificabili: quelli che acetilano sono co-attivatori mentre i deacetilanti sono co-repressori.

Nel caso delle altre modificazioni dipende dal contesto: infatti, ad esempio, in alcune circostanze un demetilante può essere un co-attivatore e in altre un co-repressore, in alcuni casi un fosforilante può essere un co-attivatore e in altre un co-repressore.

Queste affermazioni si giustificano poiché tutte le modificazioni istoniche si influenzano le une con le altre. Cosa significa “si influenzano le une con le altre”? Ad esempio affinché avvenga l’acetilazione in una certa posizione su un istone, preventivamente su un altro istone deve essere avvenuta una fosforilazione e così via.

Esistono dunque tutta una serie di “comunicazioni” tra queste modifiche, tant’è che oggi si parla di codice istonico (un codice a livello degli istoni che consente di stabilire quali sono i geni che devono espressi e quali sono i geni che devono essere repressi).

Tutto questo meccanismo e tutte queste informazioni fanno parte di una scienza che va sempre più prendendo piede e che si chiama epigenetica, tutto l’insieme di informazione che vengono trasmesse da una generazione all’altra e non sono legate alla sequenza del DNA.

(Facciamo un esempio banale: quando un epatocita si divide dà origine a due cellule figlie anch’esse epatociti. Ogni cellula ha un suo assetto cromatinico: la cromatina dell’epatocita avrà una regione eterocromatica ove saranno concentrati tutti i geni che non servono all’epatocita come quelli dei neuroni, del muscolo, etc. Quando l’epatocita si divide e dà origine a due cellule figlie, queste dovranno avere un aspetto della cromatina che sia identico a quello della cellula madre, con zone eterocromatiche, che comprendono i geni che all’epatocita non occorrono, e zone eucromatiche. Queste informazioni sulla struttura cromatinica, che sono epigenetiche, vengono trasmesse proprio grazie alle modifiche che si trovano sugli istoni).

Parliamo a questo punto di quelle molecole (co-attivatori e co-repressori) che non modificano covalentemente gli istoni,ma che modificano la cromatina.

Si tratta di complessi fatti da più proteine che rimodellano la cromatina grazie all’energia ricavata dall’ATP. Questi complessi rompono le interazione tra istoni e DNA e aumentano la mobilità dei nucleosomi, cioè li spostano lungo la fibra di cromatina (fluidità della cromatina).

Questo processo noto come meccanismo di rimodellamento della cromatina può avvenire con due modalità differenti:

• lo sliding o scivolamento;

• il cambio conformazionale

Da premettere che gli enzimi che rimodellano la cromatina non possono essere considerati co-attivatori o co-repressori in modo assoluto, ma possono essere o co-attivatori o co-repressori a seconda delle condizioni in cui funzionano.

Gli enzimi che rimodellano la cromatina hanno un funzionamento “neutro”. Il loro compito è di spostare i nucleosomi: se lo scivolamento dei nucleosomi prodotto dall’enzima libera il promotore, l’enzima avrà funzionato da co-attivatore; se lo scivolamento porta su un promotore libero i nucleosomi, l’enzima si sarà comportato da co-repressore.

È chiaro che gli attivatori richiamano gli enzimi che rimodellando la cromatina agiscono da co-attivatori, mentre i repressori richiamano gli enzimi che rimodellando la cromatina agiscono da co-repressori.

Altri enzimi funzionano facendo cambiare la forma del nucleosoma (quelli che agiscono con il cambio conformazionale). Può esservi una situazione in cui i fattori generali di trascrizione non possono accedere al promotore e il nucleosoma ha forma cilindrica. Gli enzimi modificano la forma del nucleosoma da cilindrica ad ovoidale. Il nucleosoma torna poi nella sua forma originaria. Durante questo processo, potete osservare che il promotore ha spostato la sua posizione (da bloccato sul nucleosoma diventa libero). Il cambio conformazionale può dunque liberare il nucleosoma.

A questo punto è utile ricordare la struttura della cromatina: essa è costituita da una doppia elica che si avvolge intorno ai nucleosomi.

In una fibra di 10 nm è evidente il fatto che a questo stadio di compattamento vi sono spazi tra un nucleosoma e l’altro. I nucleosomi si possono ulteriormente compattare grazie all’istone H1 (ricordiamo che gli istoni sono H1, H2A, H2B, H3 e H4 e che il nucleosoma è un ottamero fatto da H2A, H2B, H3 e H4 presi ciascuno due volte mentre H1 opera per unire i vari nucleosomi).

Il lavoro di H1 fa sì che dalla fibra di 10 nm si passi a quella più compatta di 30 nm. Un maggiore compattamento consente la formazione delle anse cromosomiche e compattando ancora si può raggiungere il cromosoma metafasico.

La fibra di 30 nm si considera eterocromatica mentre quella di 10 nm si considera eucromatica. Per essere più precisi potremmo dire che la fibra di 30 nm è border line tra l’eucromatica e l’eterocromatica e che se si muove in direzione di un maggiore compattamento diventa eterocromatica.

Riconoscendo ora le modalità con cui funzionano gli enzimi (scivolamento o cambio conformazionale) e gli stadi in cui la cromatina può trovarsi, è facile raggiungere la seguente conclusione:

• lo scivolamento ha senso sulla fibra di 10 nm (eucromatica) perché il promotore può raggiungere spazi ove non sono presenti i nucleosomi;

• il cambio conformazionale funziona efficacemente sulla fibra di 30 nm (molto compatta).

Cosa accade dopo la trascrizione?

Il frutto della trascrizione è il trascritto (RNA) che subisce le modificazioni post-trascrizionali (splicing, coda di poli-A, etc.) e poi si avvia alla sua destinazione.

Un mRNA non si presenta nudo ma è coperto da una serie di proteine che ne regolano, dopo la sua nascita, il suo funzionamento. Ad esempio CDC è una proteina che si lega al cap (al 5’P) dell’RNA e che interagisce con i pori nucleari consentendo il passaggio dell’mRNA dal nucleo al citoplasma. Siamo giunti a questo punto alla regolazione post-trascrizionale.

Bloccare il capping, l’aggiunta della coda di poli-A o altri meccanismi a questo livello, significa poter controllare ancora i destini dell’RNA prima che passi al citoplasma.

Giunto al citoplasma, l’mRNA può essere ancora controllato. Una delle modalità di regolazione post-trascrizionale è rappresentata dallo splicing alternativo che avviene nel nucleo e consente di ottenere da uno stesso RNA precursore più prodotti.

Un altro tipo di controllo post-trascrizionale è l’editing, che consiste nel cambiare la sequenza dell’mRNA al fine di ottenere un’altra proteina rispetto a quella che sarebbe altrimenti prevista.

(esempio di editing: esiste un gene, APO-B, che sintetizza una apoproteina prodotta sia nelle cellule epatiche che nelle intestinali. Il gene è ricco di esoni. La proteina prodotta nel fegato è APO-B 100, dove 100 sta per kilodalton; la proteina prodotta nell’intestino è invece APO-B 48. Nelle cellule intestinali una tripletta CAA dell’mRNA prodotto dal gene APO-B è trasformata nella tripletta UAA, codone di stop. In queste cellule quando tale messaggero sarà tradotto fornirà una proteina più breve, APO-B 48. Questo mostra come, grazie all’editing, sia possibile ottenere da uno stesso mRNA proteine diverse).

A questo punto è lecita una domanda: chi, durante il processo dell’editing, indica la base da modificare?

Vi è un’ibridazione tra l’esone e l’introne e le regioni di non perfetta ibridazione dovranno essere cambiate! (tra esone e introne non vi è perfetta complementarietà e per raggiungere quest’ultima si opera un cambiamento della base).

L’editing è detto di cambio base quando consiste nella modificazione di una base con un’altra.

Un altro tipo di editing prevede invece l’inserimento di nuove basi che prima non c’erano. In questo caso, l’mRNA “non editato” (anedited) si va a complementare con un altro RNA del nucleo, il gRNA (RNA guida). Nel gRNA e in quello anedited vi sono delle regioni che non si complementano. Per ovviare a questo problema si aggiungeranno nell’RNA pre-editato (non editato) delle basi complementari a quelle in più del gRNA. (NB: è sempre l’RNA anedited che manca di basi e che sarà sottoposto a taglio per l’aggiunta)

Nel caso dell’editing per cambio di base vi è semplice cambiamento di basi già presenti nell’RNA pre-editato; nell’editing inserzionale invece l’ibridazione dell’RNA da editare con il gRNA è finalizzata all’aggiunta e non alla semplice sostituzione di basi nell’RNA da editare. In genere le basi inserite sono delle uridine.

Le modifiche post-trascrizionali sono: capping, splicing, poliadenilazione, editing (tutto a livello del nucleo).

Eseguite queste modifiche si ha il trasporto regolato dell’RNA dal nucleo al citoplasma.

Ma quanto vive un RNA nel citoplasma? Alcuni mRNA vivono alcuni minuti, altri alcune ore. La durata della vita dipende da vari fattori che murano a difendere l’RNA dagli enzimi che lo degradano.

Le esonucleasi sono enzimi che cominciano la degradazione dell’RNA a partire dall’estremità (o 5’P o 3’OH). Le esonucleasi che degradano al 5’ si chiamano enzimi decapping (es: decapping enzime I), le esonucleasi che degradano al 3’ si chiamano enzimi depoliA.

Secondo alcuni autori affinché avvenga la degradazione della coda di poli-A, deve prima avvenire le perdita del cap. Secondo altri, i due fenomeni sono indipendenti.

Vi sono anche degli mRNA particolarmente instabili perché possiedono in se stessi il “germe dell’instabilità”. Questi hanno, ad esempio, nella regione non tradotta al 3’ (regione 3’ UTR) dopo il codone di stop, delle sequenze che si chiamano ARE (AUUUA) ripetute n-volte che legano proteine (ARE binding proteins) con il potere di richiamare endonucleasi che tagliano l’RNA e lo degradano. Dunque gli RNA con le sequenze ARE vivono di meno rispetto a quelli che ne sono privi, così come gli RNA con una lunga coda di poli-A sono più longevi di quelli che ne possiedono una breve.

Parliamo ora della regolazione traduzionale e della regolazione post-traduzionale.

Come esempio della regolazione traduzionale riportammo quella degli RNA paterni; ora invece parliamo di una proteina importante chiamata ferritina (trasporta il ferro).

L’mRNA della ferritina possiede nella regione al 5’ non tradotta (regione 5’ UTR) delle strutture a gambo e ad ansa (loop) che si chiamano IRE (iron responsive elements = elementi che rispondono al ferro). Se c’è ferro, occorre la ferritina e pertanto essa dovrà essere resa disponibile. Vi sono delle proteine, le IRE-BP (IRE binding protein) che legano le sequenze IRE. Queste proteine possono essere modificate dalla presenza del ferro: se la IRE-BP interagisce con il ferro non può più legarsi agli elementi IRE per cui avviene la traduzione della ferritina; se la IRE-BP è libera dal ferro si lega all’RNA in corrispondenza del 5’P e non ne consente la traduzione sul ribosoma.

La IRE-BP, legata all’RNA, impedisce stericamente al ribosoma di passare sull’RNA per tradurlo. Questo meccanismo fa sì che se il ferro è presente la ferritina venga prodotta mentre se è assente non venga sintetizzata.

Cosa può accadere al DNA se esposto a fattori chimici o fisici ad esso non salutari?

Il DNA si danneggia. Il danneggiamento e la rottura del DNA è uno dei motivi principali dell’invecchiamento delle nostre cellule. Nel corso dell’evoluzione si sono verificate delle modifiche a carico del DNA sia perché la polimerasi può effettuare degli errori, sia perché il DNA è suscettibile ad agenti chimici o fisici esterni.

Le mutazioni possono essere classificate in diverse categorie:

• mutazioni neutre. L’organismo non risente delle mutazioni;

• mutazioni con perdita di funzione: ad esempio, una certa proteina non può funzionare perché non tradotta bene;

• mutazioni con acquisto di funzione.

Spesso si è soliti pensare che le mutazioni per perdita di funzione siano sempre negative e svantaggiose, mentre quelle per acquisto di funzione siano sempre positive e vantaggiose. In realtà non è sempre così; infatti, ad esempio, la perdita della coda per gli uomini non è stata una mutazione svantaggiosa ma neutra. Il vantaggio e lo svantaggio sono sempre misurati in rapporto all’ambiente in cui si vive.

Le mutazioni sono:

• puntiformi: quando interessano una singola base o un singolo nucleotide. Esse si possono ancora suddividere in transizioni e transversioni. La transizione consiste nel passaggio da una purina a purina o da una pirimidina a pirimidina. La transversione consiste nel passaggio da una purina ad una pirimidina o viceversa. Con le mutazioni puntiformi si ha semplice sostituzione di basi per cui il DNA non varia nella sua lunghezza. La classificazione corrente sta però comprendendo tra le mutazioni puntiformi anche la microdelezione (perdita di un solo nucleotide) e la microinserzione (aggiunta di un solo nucleotide)

• inserzioni e delezioni: coinvolgono più nucleotidi;

• cromosomiche: coinvolgono pezzi interi di cromosoma (es: traslocazione di un pezzo di un cromosoma ad un altro. Le traslocazioni, inoltre, si dicono reciproche se due cromosomi si scambiano reciprocamente dei tratti).

All’evoluzione non sono necessarie le grosse mutazioni; infatti anche le mutazioni puntiformi sono sufficienti a garantire cambiamenti.

Le cause delle mutazioni puntiformi sono:

• errori della duplicazione;

• agenti chimici e fisici.

Le cause delle mutazioni più grosse avvengono durante la meiosi o la mitosi (es: non disgiunzione, perdita di cromosomi, etc.).

Esistono, fortunatamente, dei meccanismi di riparazione dei danni del DNA. Questi possono dividersi in quelli che avvengono prima della replicazione del DNA e in quelli che avvengono dopo la duplicazione del DNA.

I meccanismi più importanti sono i pre-replicativi perché evitano che la mutazione possa trasferirsi alle cellule figlie.

Le mutazioni, inoltre, possono essere:

• spontanee: dovuti a errori della duplicazione;

• indotte: provocate da agenti chimico-fisici.

Le basi possono passare dallo stato chetonico (normale) allo stato enolico (raro) o possono passare dalla forma amminica (più frequente) a quella imminica (più rara): si parla di tautomeria.

Mentre la DNA polimerasi sta eseguendo la polimerizzazione è possibile che una base si trovi nella sua forma rara. La DNA polimerasi non la riconosce e pone in sua corrispondenza una base a caso (ciò può essere fonte di errore durante la polimerizzazione).

La polimerasi però possiede attività esonucleasica 3’OH → 5’P di correzione di bozze (contraria alla direzione di polimerizzazione 5’P → 3’OH) che può risolvere gli errori da essa stessa eseguiti: la polimerasi si accorge dell’errore e torna indietro rimuovendo la base errata.

In alcuni casi la polimerasi non si accorge dell’errore, continua a polimerizzare e l’errore permane. La polimerasi può essere indotta all’errore anche per un altro problema. Vi sono delle regioni del DNA con sequenze ripetute: se durante la polimerizzazione l’elica di nuova sintesi estrude (esclude) una delle sequenza ripetute, riesce ancora a essere complementare allo stampo ma, per via dell’estrusione, l’elica nuova avrà una sequenza in più.