della Seconda Università degli studi di Napoli

genetica dei microrganismi

Importanza della genetica dei microrganismi:

  1. La funzione dei geni è alla base dell’attività cellulare e quindi la genetica microbica è fondamentale per comprendere il funzionamento dei microrganismi.
  2. I microrganismi rappresentano un mezzo essenziale per comprendere la genetica di tutti gli organismi.
  3. Vengono usati per isolare e duplicare specifici geni con la clonazione molecolare.
  4. Con le manipolazioni genetiche è possibile aumentare la resa e migliorare processi di produzione. L’uso su larga scala di microrganismi geneticamente modificati è uno dei principali aspetti delle biotecnologie.
  5.  Conoscendo la genetica di un microrganismo possiamo più facilmente controllare e prevenire le infezioni che può provocare.
  6. Alcuni tipi di trasferimento di materiale genetico proprio dei batteri può aiutarci a capire come possano essere trasferiti da un organismo all’altro e da una specie all’altra i geni.

Ricombinazione genetica nei procarioti

I batteri possono trasferire o scambiare DNA con altri batteri in 3  modi differenti. In ogni caso le cellule che donano il DNA sono dette donatrici e le altre riceventi. Il DNA donatore viene incorporato nell’altra cellula con uno scambio ricombinante.

 

Se lo scambio coinvolge un allele del gene del ricevente, il genoma del ricevente ed il suo fenotipo saranno cambiati. Le tre forma di scambio di DNA batterico sono:

 

  1. la trasformazione
  2. la coniugazione
  3. la trasduzione 

La trasformazione

Sin dalla sua iniziale scoperta la trasformazione è stata la via artificiale più usata per muovere i geni da un batterio ad un altro. La procedura di base include:

  • l’ottenimento di DNA purificato (naked DNA) dalla cellula donatrice.
  • Il trasferimento del DNA purificato in cellule che si trovano in uno stato detto “competente” di legarlo.
  • Le cellule riceventi prendono il DNA donato al loro interno e lo scambiano o se è un plasmide lo replicano.

 

La trasformazione è usata per muovere DNA tra batteri, piante ed animali. In ogni caso i metodi usati per introdurre il DNA nelle cellula riceventi sono lievemente diversi. Nei batteri la competenza (si definisce competente una cellula in grado di assumere una molecola di DNA e di essere trasformata) è un argomento empirico, non può cioè essere predetto quali condizioni daranno competenza in un certo ceppo di batteri

NOTA: A causa della sua estrema lunghezza la molecola di DNA si rompe facilmente e anche dopo una estrazione blanda si frammenta in 100 o più pezzi. Poiché la lunghezza media di un gene è di circa 1000 nucleotidi, ciascuno dei frammenti di DNA purificato conterrà circa 15 geni. Dal momento che ciascuna cellula incorpora generalmente uno o pochi frammenti di DNA, solo una piccola frazione dei geni di una cellula può essere trasferita da una cellula all’altra durante un singolo evento di trasformazione.

-Il processo di trasformazione del genoma batterico con DNA estratto da un virus batterico prende il nome ditrasfezione. La trasfezione può essere misurata con il saggio delle placche di lisi. La trasfezione ha il vantaggio di poter impiegare una miscela di molecole di DNA quasi completamente omogenea grazie alle ridotte dimensioni del genoma del fago.

 

-è possibile trasformare anche cellule eucariotiche e il termine usato non è trasformazione perché con questo termine si intende la conversione della cellula ad uno stato maligno, ma trasfezione

La trasduzione

Il DNA viene trasferito da una cellula ad un’altra attraverso l’intervento di un virus.

Può avvenire in due modi:

  • trasduzione generalizzata=qualsiasi porzione del genoma dell’ospite può sostituire il genoma virale nel virione maturo.
  • trasduzione specializzata=in alcuni virus temperati uno specifico gruppo di geni dell’ospite viene integrato direttamente nel genoma virale. È un sistema più efficiente di trasferimento che non la trasduzione generalizzata. Vedi esempio dell’E.coli con il fago temperato lambda.

In entrambi i casi le particelle virali saranno difettive in quanto i geni batterici avranno sostituito tutti o alcuni geni virali fondamentali per le funzioni del virus.

Quando una popolazione di batteri sensibili viene infettata da un fago, iniziano a verificarsi i fenomeni tipici di un ciclo litico; durante l’infezione, gli enzimi responsabili dell’impacchettamento del DNA talvolta introducono, accidentalmente DNA dell’ospite. La particella risultante viene detta trasducente. Alla lisi della cellula, queste particelle vengono rilasciate con i normali virioni, così il lisato contiene una miscela di virioni normali e trasducenti. Poiché le particelle trasducenti non possono iniziare un normale ciclo di infezione (non contengono DNA virale) si definiscono difettive.

La probabilità che una particella trasducente contenga un gene particolare è piuttosto bassa e generalmente solo una cellula su 106 o 108 viene trasdotta per un determinato marcatore.

Un esempio di trasduzione specializzata: la trasduzione dei geni responsabili dell’utilizzazione del galattosio mediata dal fago temperato lambda di E.coli

Il DNA di un virus temperato che non si escinde correttamente porta con sé frammenti adiacenti di DNA dell’organismo ospite. In questo modo possono essere trasdotti solo i geni localizzati in prossimità del punto di integrazione del virus, ma con alta efficienza.

Un’importante differenza tra trasduzione specializzata e generalizzata risiede nel meccanismo con cui si origina il fago trasducente. Nella trasduz. specializzata il DNA trasducente che verrà incorporato nel fago si origina in seguito all’induzione (per esempio mediante raggi ultravioletti, il DNA virale si separa da quello dell’ospite con un processo inverso a quello di integrazione) di una cellulalisogena, mentre nella generalizzata il fago trasducente si può originare, sia con questo stesso meccanismo, sia mediante l’infezione di una cellula non lisogena con un fago temperato a cui segue la replicazione del fago stesso e lisi cellulare Detta tale perché contenente un profago.

I plasmidi

Prima di parlare di coniugazione è necessario capire cosa sono i plasmidi. Questi sono descritti come mini-cromosomi. Sono composti di DNA che usualmente esiste come molecola circolare, solo un po’ più piccola  del DNA genomico

I plasmidi variano in dimensione, ma la maggior parte va dalle 1.000 alle 25.000 paia di basi contro le 4.000.000 del genoma. Replicano autonomamente  dal cromosoma genomico. Spesso ci sono molte copie plasmidiche in ogni cellula. Inoltre una cellula può contenere più tipi differenti di plasmidi o può non contenerne affatto. Generalmente trasportano geni non essenziali per la sopravvivenza della cellula eccetto speciali circostanze. Per esempio, molti plasmidi portano geni per la resistenza ad antibiotici. Alcuni la portano per più antibiotici, rendendoli pericolosi patogeni. In altri casi possono portare i geni della virulenza che aumentano la capacità della cellula di infettare un ospite. Una malattia basata su un plasmide di recente interesse è causata dall’E.Coli 0157:H7. Altri plasmidi trasportano geni per proteggere la cellula da sostanze deleterie come il mercurio, il rame o possono trasportare geni che rendono utilizzabile un inconsueto substrato, come il gasolio. Nel mondo moderno noi produciamo immense quantità di antibiotici, così che la pressione selettiva sui batteri contenenti plasmidi che trasportano geni per la resistenza agli antibiotici è intensa, particolarmente nei luoghi come gli ospedali. Come conseguenza di questo processo evolutivo gli antibiotici odierni stanno perdendo la loro efficacia. A peggiorare il problema molti dei plasmidi che trasportano geni per la resistenza agli antibiotici hanno l’abilità di muoversi da un batterio ad un altro con la coniugazione. Una singola cellula col plasmide che dà resistenza all’antibiotico può infettare molte altre cellule in una popolazione rapidamente

I plasmidi hanno anche l’importante ruolo di servire come veicoli per trasportare geni tra le cellule nella rivoluzionariaingegneria genetica.

I plasmidi che codificano per il loro trasferimento sono detticoniugativi, ma non tutti i plasmidi lo sono. La trasmissibilità mediante coniugazione è controllata da un gruppo di geni plasmidici chiamata regione tra. La presenza di questa regione in un plasmide può avere un’altra importante conseguenza nel caso in cui il plasmide si integri nel cromosoma. In questo caso il plasmide può mobilizzare il trasferimento di DNA cromosomale da una cellula ad un’altra. Ceppi batterici in grado di trasferire una grande quantità di DNA cromosomale durante il processo di coniugazione, sono detti Hfr (high frequency of ricombination).

Perdita di plasmidi

Una delle  principali caratteristiche di un plasmide è quella di poter essere perso dalla cellula ospite in seguito a trattamenti diversi. Questo processo (curing) è evidentemente dovuto all’inibizione della replicazione del plasmide senza la contemporanea inibizione della replicazione del cromosoma, per cui in seguito a divisione cellulare il plasmide non sarà ereditato da tutte le cellule.

Struttura e replicazione dei plasmidi

Uno dei plasmidi più noti è il plasmide F. Questo è coniugativo e può essere trasferito da una cellula all’altra sia isolato sia integrato col DNA cromosomale della cellula donatrice. I plasmidi che hanno la capacità di integrarsi nel cromosoma dell’ospite sono denominati, con un termine che sta andando però in disuso, episomi. Molti plasmidi di batteri Gram-negativi si replicano con un meccanismo simile a quello già descritto per il cromosoma. Poiché la replicazione del plasmide è controllata da enzimi cellulari, elementi genetici del plasmide stesso, coinvolti nella sua replicazione, possono controllare che il processo avvenga al momento giusto e che ci sia una corretta ripartizione dei plasmidi replicati tra le cellule figlie

Tipi di plasmidi

Plasmidi di resistenza

Tra i plasmidi più diffusi e più studiati, ci sono i plasmidi R, in grado di conferire resistenza agli antibiotici e a diversi altri fattori di inibizione della crescita. I plasmidi R contengono anche geni che codificano per caratteristiche non correlate con la resistenza agli antibiotici. Tra questi ricordiamo non solo la regione tra necessaria per il trasferimento, ma anche i geni per la propria replicazione e quelli che controllano la produzione di proteine che impediscono l’introduzione di plasmidi simili. Quindi la presenza di un plasmide R inibisce l’introduzione di un altro plasmide dello stesso tipo, fenomeno noto come incompatibilità. Poiché i plasmidi R possono subire ricombinazione genetica, i geni provenienti da due di essi possono integrarsi in un solo plasmide. La ricombinazione tra plasmidi è uno dei mezzi mediante il quale potrebbero essersi formati organismi con resistenza a più antibiotici

Tossine ed altre caratteristiche di virulenza

Evidenziamo due caratteristiche principali legate alla virulenza:

1)      1)      la capacità del microrganismo di attaccare e colonizzare siti specifici dell’ospite.

2)      2)      La formazione di sostanze (tossine, enzimi ed altre molecole) in grado di danneggiare l’ospite.

È noto che queste caratteristiche di virulenza sono determinate, in molti batteri patogeni, dalla presenza di plasmidi.

 

Le batteriocine

Sono agenti che inibiscono o uccidono specie strettamente correlate o anche ceppi diversi della stessa specie. Si differenziano dagli antibiotici perché quest’ultimi sono a più largo spettro d’azione. Le batteriocine sono molecole proteiche codificate in alcuni casi a livello plasmidico.

 

Incompatibilità fra plasmidi

L’incompatibilità tra plasmidi è un fenomeno di notevole importanza sia per la ricerca che per lo studio dell’evoluzione e dell’ecologia dei plasmidi. Quando un plasmide si inserisce in una cellula che già ne possiede un altro, si osserva che il secondo plasmide non può essere mantenuto e viene perso nel successivo ciclo di replicazione cellulare. In questo caso si dice che i due plasmidi sono incompatibili.

La coniugazione

È il procedimento con il quale le cellule batteriche trasferiscono DNA alle cellule con le quali sono entrate in contatto fisico. Inizialmente si pensava che avvenisse solamente tra le stesse specie o tra quelle più strettamente correlate, ma i dati accumulati mostrano che avviene anche tra Gram positivi e Gram negativi, tra batteri e cellule vegetali e tra batteri e funghi. Anche se il plasmide non può replicarsi nel nuovo ospite, il trasferimento del DNA stesso può avere importanti conseguenze dal punto di vista evolutivo, o essere coinvolto in processi di patogenesi, se in grado di combinarsi col genoma del nuovo ospite.

 

Le condizioni base per la coniugazione sono:

  • La cellula donatrice deve avere plasmidi coniugativi e viene detta maschio o F+, mentre quelle che mancano di questo tipo di plasmidi sono dette femmine o F-.
  • I plasmidi coniugativi sono responsabili della sintesi di speciali pili chiamati pili sessuali. Questi sono tubi proteici fini e lunghi che hanno recettori adesivi sulle loro estremità in modo da legarsi fermamente ai ligandi delle pareti cellulari delle cellule riceventi.
  • La natura dell’unione che si viene a creare tra le due cellule non è chiara come anche l’esatto ruolo dei pili sessuali nella sua formazione. Quello che è chiaro è che c’è passaggio di DNA tra una cellula e l’altra.
  • Uno speciale enzima taglia un filamento del DNA del donatore in un sito particolare e un nuovo filamento sintetizzato passerà nella cellula ricevente attraverso il ponte di coniugazione.
  • Quest’ultimo nuovo filamento viene convertito in un doppio filamento capace di ricombinarsi col DNA ospite con la ricombinazione.

La forma più comune di coniugazione coinvolge il trasferimento di plasmidi da una cellula all’altra. Questo processo è molto efficiente e la cellula che riceve il plasmide diventa F+.

Trasposoni e sequenze di inserzione

Il processo per cui un gene si sposta da un punto all’altro del genoma è detto trasposizione ed è un evento importante sia nell’analisi genetica che per il suo significato evolutivo.

È un evento raro: si verifica con una frequenza da 10-5 a 10-7 per generazione Þ i geni degli organismi viventi sono relativamente stabili.

Tutti i geni possono trasporre? No, questo evento è legato alla presenza di elementi genetici chiamati elementi trasponibili.

Nei batteri sono noti tre diversi tipi di elementi trasponibili

a-le sequenze di inserzione

b-i trasposoni

c-alcuni virus speciali

 

a-Hanno solo le informazioni genetiche necessarie per il loro spostamento.

Dove sono state trovate? Oltre che nel DNA plasmidico e cromosomale, anche in alcuni batteriofagi.

*sul plasmide F sono state identificate sequenze di inserzione dove può verificarsi ricombinazione omologa (non trasposizione) con sequenze identiche presenti sul cromosoma; questo permette l’integrazione del plasmide F nel cromosoma batterico e la sua modificazione.

b-Di dimensioni maggiori rispetto alle sequenze di inserzione portano geni che conferiscono

importanti proprietà all’organismo. Tra questi ricordiamo geni per la resistenza agli antibiotici e per altri caratteri facilmente selezionabili.

*alcuni batteri Gram-positivi posseggono trasposoni coniugativi, in grado anche di trasferirsi da un batterio ad un altro.

Sia le sequenze IS che gli elementi trasponibili hanno brevi sequenze ripetute invertite all’estremità del loro DNA. Queste sequenze sono coinvolte nel processo di trasposizione.

Quando un elemento trasponibile si inserisce in un altro punto del DNA (il DNA bersaglio) si verifica la duplicazione di una breve sequenza del DNA bersaglio a livello del sito di integrazione. Questa sequenza bersaglio non era presente nel trasposone , ma è l’elemento trasponibile a determinare la duplicazione di questo DNA attraverso il processo di inserzione. La duplicazione della sequenza bersaglio apparentemente si verifica in seguito all’attività dell’enzima trasposasi che induce rottura a livello di un solo filamento di DNA. Il trasposone si attacca, poi, alle estremità a singola elica generate e la riparazione delle porzioni a singolo filamento determina la duplicazione. Alcuni elementi trasponibili hanno delle sequenze bersaglio preferenziali, mentre altri, incluso il batteriofago Mu, possono inserirsi in maniera quasi del tutto casuale nel genoma.

Il meccanismo

Sono essenziali:

  •  le sequenze ripetute all’estremità degli elementi trasponibili
  •  l’enzima trasposasi che le riconosce

 

Chi codifica per quest’enzima? L’elemento trasponibile stesso!

La trasposasi riconosce, taglia e lega il DNA durante la trasposizione.

 

Sono 2 i meccanismi principali:

conservativo : rimane una sola copia del trasposone

replicativo: si ha duplicazione ed una nuova copia si inserisce in una posizione diversa Þ una copia dell’elemento trasponibile rimane nel sito originale, l’altra è localizzata nella nuova posizione.

La trasposizione è un evento ricombinativo e contrariamente alla ricombinazione omologa questa è sito specifica perché non avviene tra due sequenze omologhe ma coinvolge una specifica sequenza di basi.

Mutagenesi mediante trasposoni

Se il sito di inserzione di un elemento trasponibile è all’interno di un gene, il suo inserimento può deteminare una perdita della continuità del gene, causando una mutazione. I trasposoni sono quindi un facile mezzo per creare mutazioni nel cromosoma

 Elementi invertibili e il fenomeno della variazione di fase

Un interessante fenomeno di modificazione genetica, riconosciuta in alcuni batteri, coinvolge l’inversione di un segmento di DNA da un orientamento ad un altro. Quando il segmento è orientato in una direzione si ha l’espressione di un particolare gene, mentre, quando si trova in direzione opposta, si ha l’espressione di un altro gene. Questo meccanismo fornisce un interessante esempio di regolazione genica. Il processo mediante il quale si verifica l’inversione genica è un altro esempio di ricombinazione sito-specifica.

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