Abbiamo parlato di tutte le PCR: c’è una grossa diatriba per poter calcolare il numero di molecole finali partendo dal numero di molecole iniziali. Posso quantizzare un prodotto di PCR a patto che conosca quante molecole iniziali ho messo nella reazione, l’efficienza di amplificazione (in teoria ad ogni ciclo il DNA si duplica e corrisponde ad un’efficienza 100%: molto spesso l’efficienza di amplificazione non è 100%). Quali sono i motivi per cui l’efficienza non è al 100%?

Dipendono essenzialmente da come è fatto il primer. Immaginiamo di avere 100 molecole per studio ed avere un’enorme quantità di primer perché in effetti la reazione è a due, tra il bersaglio e il primer. Il primer è sempre in eccesso rispetto al DNA o cDNA (da 10 a 100 volte in più) perché non vogliamo che la reazione della PCR termini a causa dell’esaurimento del primer e per facilitare gli incontri tra il primer e il bersaglio (è questione di cinetica), a meno che non stiamo facendo la PCR asimmetrica in cui uno dei due primer è stato volutamente messo in quantità limitata perché vogliamo amplificare solo uno dei due filamenti.

Ma perché, se vuoi amplificare un solo filamento, fai la PCR asimmetrica mettendo due primer di cui uno in quantità ridotta e l’altro in quantità superiore? Perché con i primi cicli vogliamo comunque aumentare il numero di molecole per poi utilizzarle come stampo per quelle a singola elica.

I primer devono incontrare il bersaglio: se il primer invece di preferire l’incontro col bersaglio si struttura su se stesso, è perché ha delle regioni a gambo ed ansa (steam and loop) per cui si autostruttura (si autocomplementa). Per un fatto logico è preferito da un punto di vista termodinamico l’autostrutturarsi (reazione intramolecolare) che non andarsi ad incontrare con un’altra molecola (reazione intermolecolare).

I primer possono anche formare dimeri per cui due primer dimerizzano fra loro invece di ibridarsi con il bersaglio: anche questa formazione di dimeri è facilitata rispetto all’incontro del primer col bersaglio perché la concentrazione dei primer è molto più elevata di quella del DNA bersaglio. L’efficienza di amplificazione dipende:

• da come è strutturato il primer (dalla sua sequenza) e quindi è un fattore intrinseco e ineliminabile;

• da quante molecole di DNA bersaglio ci sono (meno molecole di DNA ci sono più l’efficienza cade perché la possibilità di incontro diminuisce) e quindi dalla quantità del DNA bersaglio e dalla qualità (se il DNA è stato estratto da un reperto tossicologico, cioè da reperti degradati). Questi sono fattori estrinseci.

In teoria: N = N_0•2ⁿ

Alla fin fine nel sequenziare il DNA non facciamo altre che utilizzare una reazione tipica di una polimerasi. Sia che abbiamo fatto la PCR, sia che facciamo il sequenziamento, andiamo ad utilizzare delle polimerasi. Se volessimo considerare chi sono i componenti del sequenziamento, sono quelli che in qualche modo utilizziamo per la PCR classica.

Per poter fare la PCR ho bisogno di: DNA da amplificare, Taq polimerasi, nucleotidi trifosfati e di una coppia di primer.

Per il sequenziamento del DNA ho bisogno del DNA da sequenziare, di una DNA polimerasi normale che funziona a 37 gradi estratta da E. coli (oppure in genere una polimerasi ingegnierizzata che non ha attività di correttore di bozze, esonucleasica 3’→ 5’ detta frammento di Klenow), nucleotidi trifosfati, un primer di innesco e infine i dideossinucleotidi trifosfati (hanno il gruppo H sia al 2’ che al 3’).

Perché si utilizza il dideossinucleotide? Poiché il suo inserimento nella catena nascente blocca la sintesi del DNA: il legame fosfodiesterico è quello che il nucleotide entrante trova il gruppo 3’OH e vi si va a legare. Se viene inserito un dideossi, il nucleotide entrante trova un 3’H e non c’è legame fosfodiesterico e la sintesi termina.

Se ho una miscela (con DNA a singola elica o denaturato) in cui è presente sia deossi che dideossi, la polimerasi ha la possibilità di inserire il nucleotide normale e la sintesi prosegue oppure il dideossi e la sintesi si arresta. Quindi per ogni posizione di polimerizzazione la sintesi si può arrestare o proseguire a seconda che la polimerasi incorpori il dideossi o il deossinucleotide corretto. Per cui, così ragionando, avrò una miscela di frammenti di DNA neosintetizzati che differiscono tra loro di un nucleotide in lunghezza (è un fatto statistico).

Esistono due tipi di sequenziamento: il sequenziamento manuale (è utile per identificare gli eterozigoti in alcune malattie puntiformi) e il sequenziamento automatico.

Il sequenziamento manuale si basa sul principio appena descritto, solo che invece di mettere in un unico tubino tutti e quattro i dideossi, dobbiamo dividere la reazione per 4: in 4 tubini diversi mettiamo il DNA, la DNA polimerasi, il primer e i deossinucleotidi mentre in ciascun tubino mettiamo un dideossi diverso: dideossiA, dideossiT, dideossiC e dideossiG.

Quindi, in ogni tubino, la reazione si fermerà dove doveva incorporare la A, la T, la C o la G. Inoltre ho marcato radioattivamente il primer di innesco al 5’P in modo tale da avere una molecola neosintetizzata radioattiva (ne avrò diverse per ogni tubino).

Dopo un certo tempo termina la polimerizzazione e andrò a separare i frammenti di DNA presenti nei 4 tubini con un gel elettroforetico di acrilammide, poiché ha le maglie più strette in modo da separare frammenti che differiscono di un singolo nucleotide. Terminata la corsa elettroforetica, abbiamo un gel in cui i vari frammenti si sono separati e sono radioattivi: prendiamo il gel, lo mettiamo a contatto con una lastra autoradiografica e la radiazione colpirà la lastra, che verrà impressionata e sviluppata.

Come si legge una sequenza nucleotide per nucleotide? Dal frammento più piccolo (più vicino al primer) al più grande, dal basso verso l’alto [nella diapositiva 13 in basso a destra (dove leggo G significa che ho messo la dideossiC)].

In questo modo possiamo fare una diagnosi di mutazione puntiforme.

Il sequenziamento si potrebbe ipoteticamente fare anche su DNA non amplificato con PCR, ma la quantità di DNA è minima e non si può sequenziare adeguatamente: conviene fare PCR e sequenziamento (migliore del normale gel di agarosio). Gli eterozigoti si vedono bene con il gel di acrilammide: se è vero che per ogni posizione c’è sempre una sola banda, nel caso degli eterozigoti in una posizione troverò due bande diverse (ad esempio una T e una G) perché una volta è stato sequenziato un allele e una volta è stato sequenziato l’altro allele (ciò significa che il DNA in quella regione ha due alleli differenti per una base). Ciò è importante nelle talassemie in cui un gene di una globina α o β è mutato e l’altro no.

Questo tipo di sequenziamento è lungo e inoltre, per un limite intrinseco alla reazione, il frammento che leggiamo, per quanto il gel possa essere lungo, non va oltre i 500 nucleotidi.

Per quanto riguarda il sequenziamento automatico, è possibile determinare la sequenza nucleotidica di una regione di DNA, a partire da una soluzione di DNA amplificato e purificato, utilizzando un sistema di apparecchiature che determinano e visualizzano automaticamente il risultato: il sequenziatore automatico.

Questo presenta i 4 dideossi in un unico tubino; il primer non è marcato radioattivamente. Ogni base di un dideossi è coniugata, cioè marcata, ad un fluorocromo diverso, cioè ad una sostanza che se colpita da un raggio di luce emette fluorescenza.

All’interno del sequenziatore i frammenti della miscela vengono separati e ordinati secondo la loro lunghezza grazie alla presenza di un capillare contenente acrilammide e poi colpiti da un raggio di luce laser che eccita i fluorocromi coniugati ai dideossi. Ad ogni posizione l’apparecchio legge il tipo di fluorescenza: viene rilevata una emissione di fluorescenza di colore diverso per ognuno dei quattro dideossi e un software ricostruisce la sequenza del frammento iniziale di DNA abbinando a ciascuna emissione luminosa il corrispondente ddNTP.

Il laser si sposta lungo il gel e ad ogni posizione andrà a vedere quale fluorescenza viene emessa. Il computer subito trasforma la fluorescenza nella base corrispondente e automaticamente ci dà la sequenza grazie al cosiddetto elettroferogramma.