Kary Mullis ha inventato la PCR. Nel 1990 è stata messa a punto la tecnica della PCR che oggi è alla base di tutti le analisi nei laboratori. Mullis ha ideato la tecnica nel ’83. E’ un procedimento molto semplice che consente di ottenere il numero elevatissimo di copie di un specifico segmento di dna. La pcr è una tecnica sensibilissima che consente di rilevare la presenza di dna o del rna partendo da quantità minime di materiale biologico. E’ la tecnica di elezione per quanto riguarda le analisi sia genetiche che di ricerca. Es se vuoi estraete del dna dalle cellule partendo da un prelievo di sangue,per poter effettuare un soutern blot voi dovete avere dai 5 al 10 ml di sangue , perchè vi occorre una certa quantità di sangue per analizzare il genoma…poi grazie alla sonda andate ad identificare il frammento di vostro interesse. Se volete analizzare un frammento di dna tramite la PCR , la quantità di sangue che vi occorre è pochi microlitri.( quindi notate la differenza di grandezza tra ml e microlitri).questo perché la PCR vi aumenta il numero di copie del frammento di dna a vostra disposizione.

Domanda: perché devo aumentare il numero dei frammenti???

RISp: per poterlo poi analizzare!!!se voi avete a disposizione una quantità minima di dna è difficile che questa venga visualizzata sul gel, se invece aumentate la quantità di copie lo rendete visibile!!!!cioè la pcr vi serve per aumentare le copie e poi con le tecniche dell’agarosio, del gel voi potete analizzare il dna.

#( con le tecniche che menzionato nelle scorse lezioni possiamo evidenziare le inserzioni,le delezioni, i tagli di certa entità sul dna…. Invece il seguenziamento di un gene ancora non abbiamo detto come si fa… lo faremo nelle prossime lezioni… ps se vuoi volete ampliare il numero di copie di un tratto di dna deleto con la pcr questo non si amplificherà….se invece nel frammento è avuta un inserzione io amplificherò un segmento più grande…con queste tecniche quindi prendiamo in considerazione grosse modificazioni al livello del dna, ma rimangono fuori tutte quelle patologie dovute alle mutazioni puntiformi es anemia falciforme nn la evidenziate con soutern blot e quindi dovete avere tecniche per seguenziare il gene… la pcr da un aiuto per seguenziare il gene ,ma questo lo vedremo prossimamente)#…

Prima di tutto per effettuare la pcr devo sapere quale segmento voglio amplificare. La pcr nn fa altro che utilizzare la dna polimerasi e fa lavorare ciclicamente questa dnapol che ad ogni ciclo di replicazione raddoppierà il num delle molecole.

DOMANDA: come fai ad aumentare il num di copie del frammento? RISP: sfruttando la polimerasi che ad ogni ciclodi duplicazione mi raddoppia le molecole!!!!!

Per amplificare ho bisogno di: 1) dna ,2) 2 primer di innesco di dna e sono quelli che mi delimiteranno la zona che voglio amplificare; 3) polimerasi che si chiama TAQpol perchè è l’acronima di termophilus aquaticus.questo è stata estratta da 1batterio che funziona ad alte temperature( 72-75°C) 4) nucleotidi per far avvenire la polimerizzazione; 5) soluzione tampone che contiene il sale di magnesio che favorisce l’attacco della pol al dna. (Variando la concentrazione del magnesio variate l’affintà di legame della pol con il suo substrato) 6)apparecchio termociclatore che serve per far avvenire la pcr.

( il primer deve essere posizionato all’interno della zona da amplificare perché i primer faranno parte del seg replicato in quanto è fatto di dna ..inoltre preso un segmento di dna che presenta sopra 5’→3’ e sotto 3’→5’,( il pramer devono essere antiparalleli) il primer deve essere posizionato verso 3’su entrambe le eliche…in questo modo avverà la duplicazione del tratto che vi interessa , se invece lo posizionate verso il 5’ la dna polim polimerizzerà tutti tranne quel tratto che vi serve) (vedi slide 4)

Il primer è di dna per fatti economici e tecnici perché il primer di rna si degrada più facilmente e costa di più.

Ogni fase di duplicazione si chiama ciclo di pcr, quindi al termine di ogni ciclo io dovrei aver raddoppiato il numero delle regioni di dna. Ogni ciclo di suddivide in tre fasi: 1)denaturazione; 2)annealing ; 3)estenzione.

Il dna viene denaturato a 94°C per poter far aderire la polim. Perchè questa temperatura? RISP: a questa temp sicuramente il dna generico si denatura ( Tm= e la temperatura alla quale metà delle molecole è a doppia elica e metà a singola elica. Tm dipende da 1) lunghezza dna 2) composizione in basi 3) la concentrazione salina). Per quanto possa essere lungo un dna, o qual è la sua composiz di basi, a 94° di sicuro siamo a al di sopra della Tm.

Il termociclatore può essere considerato come una stufa-frigorifero perché riesce a raggiungere in poco tempo temperature differenti.

Dopo che abbiamo denaturato dobbiamo consentire annealing tra primer e dna. La temperatura scende tra 30-65°C. La temperatura scelta in fuzione della composizione in basi, lunghezza dei primer e della concentrazione salina , per consentire l’appaiamento fra gli inneschi e le 2 eliche di dna ad essi complementari.

Domanda: perché la temperatura di denaturazione è fissa a 94 e quella di annealing oscilla tra 30-65? risp:dipende dalla lunghezza del prime: se esso è lungo la temperatura sarà più alta se il prime è corta la temperatura sarà più bassa!

Dom: tem di annealing è più alta o più bassa di Tm? Risp: più bassa (5-10°in meno a tm) perché voglio che nn sia il 50 % del primer a legarsi , ma il maggior numero possibile.( lo stesso discorso vale per la sonda nel nortern e souther blot). Nn molto al di sotto perché altrimenti il primer si comincerebbe a legare anche con quelle regioni del dna con cui non è complementare al 100%. La temperatura di 5- 10 gradi è specifica per le regioni complementari al 100%, invece a temperature basse comincia ad essere possibile creare legami tra primer e dna che sono complementari anche al 50-70% e rimangono legati perché la temperatura lo permette!il primer si deve legare solo alla zona per la quale è stato progettato!!!!

Il primer sono in genere rientrano tra 18 e 35 nucleotidi! Nn sono più corti perché andrebbero a riconoscere più zone complementari di dna, più lungo il primer andrebbe ad avvolgersi su se stesso formando dei loop che ne impedirebbero la su perfetta interazione con la zona specifica di dna. Statisticamente è stato dimostrato che su 3miliardi di coppie di basi se io voglio riconoscere una zona unica del nostro dna il primer deve essere lungo almeno 15 nucleotidi… noi la utilizziamo intorno a 18 per essere sicuri!!!

Dopo che avvenuto annealing , vi è la fase dell’estenzione . La temperatura sale a 72° e la taq pol sintetizza i nuovi filamenti di dna partendo dai due inneschi in direzione 5’→3’ utilizzando come stampo le due eliche di dna.

domanda: perché si usa la TAQpol? Perché se io utilizzassi una normale dna pol questa ad ogni ciclo sarebbe distrutta perché si denatura e io ad ogni ciclo dovrei aggiungere dnapol nuova. Invece la Taqpol andando a 94 gradi subisce dei danni minimi perché resiste a queste temperature e può essere riutilizzata per vari cicli. Certo essa non è eterna, però cmq è sempre più vantaggiosa della normale dna pol.

Quando Mullis ha progettato la tecnica non c’era il termociclatore, quindi bisognava avere tempi maggiori per effettuare ogni ciclo. Adesso, con il termociclatore, per ogni fase ci vuole da 30sec ad 1 min. ecco che i tempi si sono molto ridotti. In genere si compiono dai 30 a 40 cicli. Oltre non si va perché poi la polimerasi si inattiva e si cominciano a formare i corpi di scarto PIRFOSFATI che impediscono ulteriore amplificazione.

Cosa viene fatto del frammento amplificato? viene analizzato sul gel di agarosio e poi andate a verificare se vi sono delezioni ed inserzioni. Oppure dopo aver fatto la pcr andate a seguenziare il tratto.

L’aumento delle copie di dna è esponenziale (vedi diapositiva 30) fino ad un certo numeri di cicli, dopo di che raggiunge un plateau, cioè la fase dove non viene più duplicato il dna. Questo per 2 motivi: 1) la Taqpol comincia a disattivarsi. 2) si accumulano i pirofosfati che vanno ad inebire la polimerasi.

Esiste una relazione linerare tra il numero di coppie di partenza e quelli finali, questa relazione è valida finchè non si raggiunge il plateau. Questo è importante perchè sapendo quante molecole avete alla fine potete sapere quante ne erano all’inizio, tutto questo a patto che voi fermate i cicli prima di raggiungere il plateau. perchè in quella fase la relazione non è più valida.

(vedi diapos 11)→la tecnica di pcr è altamente sensibile che la contaminazione che può avvenire facilmente se il tecnico di laboratorio non sta attento: si verificano i falsi positivi. Per controllo noi effettuiamo il controllo negativo (utilizziamo una provetta con il materiale su cuoi non effettuiamo la pcr).

Utilizzo della pcr: 1)nelle indagini di strage quando il reperto è molto piccolo ( saliva sul mozzicone di sigaretta, sperma,capello, cello di sfaldamento); 2) quando non abbiamo sangue ma solo capelli o altri reperti e la quantità di dna è minima; 3) casi di stupro; 4) reisumazione di cadaveri per caso di paternità;

5) ricerca della sindrome di distrofia muscolare ; 6) test di paternità. 7) quantizzare la differenza di espressione genica. 8)analisi di malattie tumorali. 9) test prenatali. 10) ricerca di HIV ,HCV

A causa dell’ estrema sensibilità della pcr, se viene manovrata male dal operatore vi possono risultare dei falsi positivi!ad esempio se l’operatore “sputacchia” sul reperto mentre parla quella è una delle possibili contaminazioni!!!

Il primer deve essere ben progettato perché è quello che ci permettere di individuare la zona che a noi serve!

Il primer è composto tra 18-30 nucl

La composizione in G-C tra 40-75% ( oggi questo viene già automaticamente fatto dai macchinari)il prime non deve auto assemblarsi in strutture a loop. inoltre è preferibile evitare la T all’estremità 3’ perché si potrebbe staccare più facilmente questo estremo dal dna.

Il primer non deve avere regioni di parziali complementarietà ( vedi slide 21) per non formare dimeri!! inoltre deve essere regolata la concentrazione delle basi: se è maggiore la quantità di C-G o T-A cambia la Tm.

La tm inizialmente si calcolava a mano, oggi viene fatto automaticamente!!!!( vedi la formula sulle slide22)…

MER = è il modo per indicare la lunghezza delle molecole di dna a singola elica. 20mer = segmento di 20 nucleotidi

(Slide 27) questa slide riassume tutto il processo della pcr:a)dna di partenza; b) si inseriscono i primer al 3’ di ciascuna emielica;c) la polimerasi comincia a polimerizzare e va oltre il segmento; d) nel ciclo successivo ho 4 stampi ( 2 eliche di partenza +2 sintetizzate nel ciclo precedente), i 2 nuovi stampi sono già un po’ più corti rispetto ai primi. Di nuovo si aggiungono i primer e si continua il nuovo ciclo. Ciclo dopo ciclo la quantità dei frammenti di giusta grandezza cominciano a prevalere su quelli di grandezza variabile. Dopo il terzo ciclo per la prima volta gli ampliconi sono prodotti di lunghezza giusta! Quindi comincia l’amplificazione esponenziale.

La formula per sapere quante molecole ho dopo vari cicli : N(1+Y)ⁿ-1.

N = numero di molecole di partenza ; n-1= è il numero di cicli – 1.Y sarebbe uguale ad 1 se noi veramente ad ogni ciclo raddoppiassimo le molecole, in realtà ciò non accade , quindi Y corrisponde all’efficienza dell’amplificazione. In un ciclo esattamente non raddoppiamo il numero di molecole ,ma le aumentiamo. Questo è dovuto al fatto che non tutti i primer si ibridano veramente alle molecole di dna. l’efficienza oltre a dipendere dal primer dipende dalla qualità del dna (il dna ha legato a se delle proteine che inveiscono l’attacco del primer),e dalla concentrazione bassa di dna iniziale. Raggiunto il plateau l’efficienza è pari a 0,invece durante la curva esponenziale l’efficienza si mantiene costante!!

Ps quando all’esame il prof chiede di amplificare una zona del dna delimitata (che lui richiede) i primer devono essere posizionati all’interno della zona indicata e nn all’esterno altrimenti si amplifica una zona più grande,e poi viene posizionato all’interno perché i primer SONO FATTI DI DNA E QUINDI NN VENGONO DISTRUTTI MA VANNO A FAR PARTE DEL SEGMENTO REPLICATO!!!

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